Ядро может содержать ядерный скелет, который помогает организовать его функции

В предыдущих статьях на сайте мы рассмотрели некоторые ядерные домены и субкомпартменты , которые обладают уникальным составом и функциями. В ядре также происходят другие процессы, например репликация ДНК. Считается, что макромолекулярные аппараты репликации и сплайсинга могут быть связаны с определенными структурами ядра.

В ранней S-фазе цикла , когда происходит синтез , в клетке существует много сайтов репликации. По мере протекания синтеза они сливаются, и в результате остаются лишь несколько десятков более крупных сайтов. Эти крупные сайты называются фабрики репликации ДНК.

На рисунке ниже показано распределение этих фабрик в различных стадиях S-фазы . Поскольку в каждый момент времени количество точек начала репликации превышает количество фабрик репликации, то каждая фабрика должна содержать десятки или сотни точек начала репликации. Аналогичные исследования позволяют предполагать, что транскрипция также может происходить в ограниченном количестве сайтов, называемых фабрики транскрипции.

Локализация биосинтетических процессов в отдельных сайтах позволяет предполагать существование в ядре некой опорной структуры. Упорядоченная скелетная структура, напоминающая цитоскелет , в ядре отсутствует. Однако некоторые исследования позволяют предполагать наличие в ядре сетеобразной структуры, которая называется ядерный матрикс.

В отличие от цитоскелета матрикс становится видимым только после обработки ядра детергентами, ДНКазой и растворами высокой ионной силы. При такой обработке удаляется много компонентов, включая почти всю ДНК и мембраны, а остаются только нерастворимые белки и часть РНК. Матрикс содержит короткие волокна, по размеру близкие к промежуточным филаментам, актину (но не к его фибриллярной форме) и ко многим другим белкам. Эти компоненты не организуются в более крупные структуры.

Поскольку ядерный матрикс растворим относительно плохо, его трудно изучать как целое. Некоторые исследователи полагают, что ядерный матрикс представляет собой артефактную структуру, поскольку становится видимым только после жесткой процедуры экстракции. Однако, поскольку в ядре происходят многие важные и сложные процессы, которые должны выполняться с максимальной точностью, возможно существование некой организующей опорной структуры.

К числу возможной функции опорной ядерной структуры относится организация молекулярных машин репликации, транскрипции и процессинга РНК, которые представлены реплисомой, комплексом РНК-полимераза II-холофермент и сплайсеосомой соответственно. Хотя эти большие мультисубъединичные комплексы обладают гораздо меньшей массой, чем хромосомы, по размеру они превышают свои субстраты - нуклеиновые кислоты.

Данные исследования структуры этих комплексов показывают, что они обладают специальной канавкой, обеспечивающей прохождение цепи нуклеиновой кислоты по комплексу. По данным многих исследований, эти комплексы присоединены к опорной ядерной структуре. Это означает, что когда начинается репликация, транскрипция и сплайсинг, соответствующие молекулярные машины фиксируются, и через них продвигаются нуклеиновые кислоты.

Репликация ДНК происходит в ограниченном количестве сайтов, которые называются фабрики репликации.
ДНК метится бромдезоксиуридином (BrdU) и визуализируется с использованием антител к BrdU, конъюгированных с флуорофором.
Представлены фотографии клеток в различные промежутки времени после митоза.
Ферментативные фабрики,
осуществляющие репликацию ДНК и сплайсинг РНК,
могут быть связаны с ядерным матриксом.

Ядерный скелет (ядерный матрикс)

Ультраструктура. Ядерный скелет представляет собой следующую систему:

• плотная пластинка (ламина) с норовыми комплексами;
• фибриллярно-гранулярная сеть.

В состав скелета входят негис- тоновыс белки (в том числе актин и миозин), факторы транскрипции, полисахариды, липиды, нуклеиновые кислоты.

Функции. Ядерный скелет выполняет следующие функции:

• поддерживает форму ядра;
• является опорой для хроматиновых структур (в частности, с помощью ядерного скелета хромосомы внутри ядра занимают совершенно определенные нсперекрывающисся области - хромосомные территории; при этом хромосомы, содержащие большое число генов, локализуются ближе к центру ядра);
• обеспечивает внутриядерный транспорт частиц и веществ;
• участвует в регуляции транскрипции.

Биогенез. Формируется в телофазе из растворенных белков.

Ядрышко

Строение. Округлое компактное образование преимущественно нитчатого строения. Структурные компоненты:

• нуклеолонема (основная нитчатая структура, состоит из рибо- ][уклеопротеид] iых нитей);
• гранулярный компонент (рибонуклеопротеидные гранулы);
• ядрышковый хроматин.

Биохимическая характеристика. В состав ядрышка входят следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида) содержит гены, кодирующие pPIIK;
• ферменты транскрипции;
• рРНК;
• рибонуклеопротеиды (фибриллы и гранулы - рибосомы на разных стадиях созревания);
• негистоновые белки;
• минеральные компоненты.

Функции. Ядрышко выполняет следующие функции:

• биосинтез РНК;
• сборку рибосомиых частиц (белки приходят из цитоплазмы).

Биогенез. Формируется в телофазе при участии ядрышкового

организатора - специального участка определенной хромососы (подробнее см. морфологическую классификацию хромосом на с. 84).

Хроматиновые структуры

Хроматин и хромосомы - две формы существования одного материала: в ядрах неделящихся клеток - хроматин, в делящихся митозом или мейозом - хромосомы.

Биохимическая характеристика. Хроматиновые структуры содержат следующие компоненты:

• ДНК (в форме дезоксирибонуклеопротеида);
• гистоновые белки;
• нсгистоновыс белки (регуляторные, рецепторные белки и др.);
• ферменты (ДНК-полимераза, РНК-полимераза и др.);
• и PH К, тРНК;
• прочие (минеральные компоненты, липиды и др.).

Молекулярная организация. Хроматиновые структуры представляют собой линейные полимерные образования, состоящие из множества однотипных структурных единиц - нуклеосом. Основу (сердцевину, или кор) нуклеосомы составляет образование, состоящее из восьми молекул гистоновых белков, на которое намотаны в виде левозакручеииой суперспирали 1,75 витка ДНК общей длиной 145 нуклеотидных пар (рис. 3.31). При этом молекулы гистонов взаимодействуют с молекулой ДНК таким образом, что положительно заряженные радикалы входящих в их состав аминокислотных осгаткон нейтрализуют отрицательно заряженные фосфатные группы остова ДНК. Этим обстоятельством объясняется столь компактная упаковка хроматиновых структур в ядре (длина ДНК человека составляет 1,7-2 м, а диаметр клеточного ядра - не более 5-7 мкм).

Молекула ДНК непрерывна и переходит с одной нуклеосомы на другую, соединяя их в линейную структуру - нуклеосомную нить. Участок ДНК между нуклеосомами называется линкерной ДНК; ее протяженность составляет 10-100 нуклеотидных пар. Молекула ДНК не имеет свободных концов. В конечных участках плечей хромосом (теломерах - см. ниже) она образует петлю, фиксированную специальными (теломерными) белками (рис. 3.32), благодаря чему молекула ДНК оказывается защищенной от соединения с концами других молекул ДНК (или двунитевыми разрывами) и от разрушающего действия ферментов.

Рис. 331. Рис. 3.32. Петля ДНК, фиксированная

1 - ДНК; Н2А, Н2В, НЗ, Н4 - специальными белками в области гистоновые белки теломеры (теломерные белки

представлены в виде объемных тонированных фигур)

Ядерный матрикс

представляет собой систему фибриллярных белков, выполняющих как структурную (скелетную) функцию, так и регуляторную в процессах репликации, транскрипции, созревании молекул РНК (процессинг) и перемещении их как внутри ядра, так и за его пределами.

Кариоплазма -- субсистема ядерного аппарата, аналогичная гиалоплазме. Кариоплазма -- второй компонент внутренней среды клетки. Она создает для ядерных структур специфическое микроокружение, обеспечивающее им нормальные условия для функционирования. Благодаря наличию в ядерной оболочке поровых комплексов кариоплазма взаимодействует с гиалоплазмой.

Структурами ядра, ответственными за хранение и передачу наследственной информации клетки, являются хромосомы, состоящие из дезоксирибонуклеопротеидов. Хромосомы целиком видны только в клетках, делящихся митозом. В некоторых хромосомах имеются вторичные перетяжки -- ядрышковые организаторы. В них локализована ДНК, ответственная за синтез рРНК.

Одномембранные органоиды

Лизосомма -- окружённый мембраной клеточный органоид, в полости которого поддерживается кислая среда и находится множество растворимых гидролитических ферментов. Лизосома отвечает за внутриклеточное переваривание макромолекул, в том числе при аутофагии; лизосома способна к секреции своего содержимого в процессе лизосомного экзоцитоза; также лизосома участвует в некоторых внутриклеточных сигнальных путях, связанных сметаболизмом и ростом клетки.

Лизосомы были открыты в 1955 году бельгийским биохимиком Кристианом де Дювом. Лизосомы есть во всех клетках млекопитающих, за исключением эритроцитов.

С нарушением функций лизосом связан ряд наследственных заболеваний у человека, называемых лизосомными болезнями накопления.

Один из признаков лизосом -- наличие в них ряда ферментов (кислых гидролаз), способных расщеплять белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. К числу ферментов лизосом относятся катепсины (тканевые протеазы), кислая рибонуклеаза, фосфолипаза и др. Всего полость лизосомы содержит около 60 растворимых кислых гидролитических ферментов.

Для лизосом характерна кислая реакция внутренней среды, которая обеспечивает оптимум работы лизосомных гидролаз. Деградация достигается за счет присутствия в лизосомах различных расщепляющих ферментов -- гидролаз с оптимумом действия в кислой области. Главный фермент лизосом -- кислая фосфатаза. В мембране лизосом находятся АТФ-зависимые протонные насосы вакуольного типа. Они обогащают лизосомы протонами, вследствие чего для внутренней среды лизосом рН 4,5-5,0 (в то время как в цитоплазме рН 7,0-7,3). Лизосомные ферменты имеют оптимум рН около 5,0, т. е. в кислой области. При рН, близких к нейтральным, характерным для цитоплазмы, эти ферменты обладают низкой активностью. Очевидно, это служит механизмом защиты клеток от самопереваривания о том случае, если лизосомный фермент случайно попадет в цитоплазму.

Различают первичные и вторичные лизосомы. Первые образуются в области аппарата Гольджи, в них находятся ферменты в неактивном состоянии, вторые же содержат активные ферменты. Обычно ферменты лизосом активируются при понижении рН. Среди лизосом можно также выделить гетеролизосомы (переваривающие материал, поступающий в клетку извне -- путём фаго- или пиноцитоза) и аутолизосомы (разрушающие собственные белки или органоиды клетки). Наиболее широко используется следующая классификация лизосом и связанных с ними компартментов:

Ранняя эндосома -- в неё поступают эндоцитозные (пиноцитозные) пузырьки. Из ранней эндосомы рецепторы, отдавшие (из-за пониженного рН) свой груз, возвращаются на наружную мембрану.

Поздняя эндосома -- в неё из ранней эндосомы поступают пузырьки с материалом, поглощённом при пиноцитозе, и пузырьки из аппарата Гольджи с гидролазами. Рецепторы маннозо-6-фосфата возвращаются из поздней эндосомы в аппарат Гольджи.

Лизосома -- в неё из поздней эндосомы поступают пузырьки со смесью гидролаз и перевариваемого материала.

Фагосома -- в неё попадают более крупные частицы (бактерии и т. п.), поглощённые путём фагоцитоза. Фагосомы обычно сливаются с лизосомой.

Аутофагосома -- окружённый двумя мембранами участок цитоплазмы, обычно включающий какие-либо органоиды и образующийся при макроаутофагии. Сливается с лизосомой.

Мультивезикулярные тельца -- обычно окружены одинарной мембраной, содержат внутри более мелкие окружённые одинарной мембраной пузырьки. Образуются в результате процесса, напоминающего микроаутофагию, но содержат материал, полученный извне. В мелких пузырьках обычно остаются и затем подвергаются деградации рецепторы наружной мембраны (например, рецепторы эпидермального фактора роста). По стадии формирования соответствуют ранней эндосоме.

Остаточные тельца (телолизосомы) -- пузырьки, содержащие непереваренный материал (в частности, липофусцин). В нормальных клетках сливаются с наружной мембраной и путем экзоцитоза покидают клетку. При старении или патологии накапливаются.

Функциями лизосом являются:

переваривание захваченных клеткой при эндоцитозе веществ или частиц (бактерий, других клеток)

аутофагия -- уничтожение ненужных клетке структур, к примеру, во время замены старых органоидов новыми, или переваривание белков и других веществ, произведенных внутри самой клетки

Автолиз -- саморазрушение клетки, наступающее вследствие высвобождения содержимого лизосом. В норме автолиз имеет место при метаморфозах (исчезновение хвоста у головастика лягушек), инволюции матки после родов, в очагах омертвления тканей.

Некоторые редко встречающиеся заболевания связаны с генетическими дефектами лизосомных ферментов, так как эти ферменты участвуют в деградации гликогена (гликогенозы), липидов (липидозы) и протеогликанов(мукополисахаридозы). Продукты, которые не могут участвовать в метаболизме из-за дефектов или отсутствия соответствующих ферментов, накапливаются в остаточных телах, что приводит к необратимому повреждению клеток и как результат к нарушению функций соответствующих органов.

Пероксисома

Обязательная органелла эукариотической клетки, ограниченная мембраной, содержащая большое количество ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции (оксидазы D-аминокислот, уратоксидазы и каталазы). Имеет размер от 0,2 до 1,5 мкм, отделена от цитоплазмы одной мембраной.

Набор функций пероксисом различается в клетках разных типов. Среди них: окисление жирных кислот, фотодыхание, разрушение токсичных соединений, синтез желчных кислот, холестерина, а также построение миелиновой оболочки нервных волокон, и т. д. Наряду с митохондриями пероксисомы являются главными потребителями O2 в клетке.

В пероксисоме обычно присутствуют ферменты, использующие молекулярный кислород для отщепления атомов водорода от некоторых органических субстратов () с образованием перекиси водорода ():

Каталаза использует образующуюся для окисления множества субстратов -- например, фенолов, муравьиной кислоты, формальдегида и этанола:

Этот тип окислительных реакций особенно важен в клетках печени и почек, пероксисомы которых обезвреживают множество ядовитых веществ, попадающих в кровоток. Почти половина поступающего в организм человека этанола окисляется до ацетальдегида этим способом. Кроме того, реакция имеет значения для детоксикации клетки от самой перекиси водорода.

Длительность жизни пероксисом незначительная -- всего 5-6 суток. Новые органоиды образуются чаще всего в результате деления предшествующих, как митохондрии. Они, однако, могут формироваться и de novo из эндоплазматического ретикулума.

Все ферменты, находящиеся в пероксисоме, должны быть синтезированы на рибосомах вне её. Для их переноса из цитозоля внутрь органеллы мембраны пероксисом имеют систему избирательного транспорта. Открыты бельгийским цитологом Кристианом де Дювом в 1965.

Аппарат Гольджи является компонентом всех эукариотических клеток (практически единственное исключение - эритроциты млекопитающих). Он представляет собой важнейшую мембранную органеллу, управляющую процессами внутриклеточного транспорта. Основными функциями аппарата Гольджи являются модификация, накопление, сортировка и направление различных веществ в соответствующие внутриклеточные компартменты, а также за пределы клетки. Он состоит из набора окруженных мембраной уплощенных цистерн, напоминающих стопку тарелок. Со стопками Гольджи всегда ассоциирована масса мелких (диаметром приблизительно 60 нм) ограниченных мембраной пузырьков. Многие пузырьки являются окаймленными и покрыты клатрином или другим специфическим белком. Аппарат Гольджи имеет две разные стороны: формирующуюся, или цис-сторону и зрелую, или транс-сторону. Цис-сторона тесно связана с переходными элементами ЭР; транс-сторона расширяется, образуя трубчатый ретикулум, называемый транс-сетью Гольджи. Белки и липиды в составе небольших пузырьков попадают в стопку Гольджи с цис-стороны, а покидают ее, направляясь в различные компартменты, вместе с пузырьками, образующимися на транс-стороне. Переходя из одной стопки Гольджи в другую, эти молекулы претерпевают последовательные серии модификаций.

Хорошо развитый аппарат Гольджи присутствует не только в секреторных, но и практически во всех клетках эукариотических организмов.

Функции

• 1) сортировку, накопление и выведение секреторных продуктов;
• 2) завершение посттрансляционной модификации белков (гликозилирование, сульфатированиеи т.д.);
• 3) накопление молекул липидов и образование липопротеидов;
• 4) образование лизосом;
• 5) синтез полисахаридов для образования гликопротеидов, восков, камеди, слизей, веществ матрикса клеточных стенок растений (гемицеллюлоза, пектины) и т.п.
• 6) формирование клеточной пластинки после деления ядра в растительных клетках;
• 7) участие в формировании акросомы;
• 8) формирование сократимых вакуолей простейших.

В Комплексе Гольджи выделяют 3 отдела цистерн, окружённых мембранными пузырьками:

Цис-отдел (ближний к ядру);

Медиальный отдел;

Транс-отдел (самый отдалённый от ядра).

Эти отделы различаются между собой набором ферментов. В цис-отделе первую цистерну называют «цистерной спасения», так как с её помощью рецепторы, поступающие из промежуточной эндоплазматической сети, возвращаются обратно. Фермент цис-отдела: фосфогликозидаза (присоединяет фосфат к углеводу -- маннозе). В медиальном отделе находится 2 фермента: манназидаза (отщепляет манназу) и N-ацетилглюкозаминтрансфераза (присоединяет определенные углеводы -- гликозамины). В транс-отделе ферменты: пептидаза (осуществляет протеолиз) и трансфераза (осуществляет переброс химических групп).

Аппарат Гольджи асимметричен -- цистерны, располагающиеся ближе к ядру клетки (цис-Гольджи) содержат наименее зрелые белки, к этим цистернам непрерывно присоединяются мембранные пузырьки -- везикулы, отпочковывающиеся от гранулярного эндоплазматического ретикулума (ЭПР), на мембранах которого и происходит синтез белков рибосомами. Возвращение белков из аппарата Гольджи в ЭПС требует наличия специфической сигнальной последовательности (лизин-аспарагин-глутамин-лейцин) и происходит благодаря связыванию этих белков с мембранными рецепторами в цис-Гольджи.

В цистернах аппарата Гольджи созревают белки предназначенные для секреции, трансмембранные белки плазматической мембраны, белки лизосом и т. д. Созревающие белки последовательно перемещаются по цистернам в органеллы, в которых происходят их модификации -- гликозилирование и фосфорилирование. При О-гликозилировании к белкам присоединяются сложные сахара через атом кислорода. При фосфорилировании происходит присоединение к белкам остатка ортофосфорной кислоты. Созревающие белки «маркируются» специальными полисахаридными остатками (преимущественно маннозными), по-видимому, играющими роль своеобразного «знака качества».

Транспорт белков из аппарата Гольджи

В конце концов от транс-Гольджи отпочковываются пузырьки, содержащие полностью зрелые белки. Главная функция аппарата Гольджи -- сортировка проходящих через него белков. В аппарате Гольджи происходит формирование «трехнаправленного белкового потока»:

созревание и транспорт белков плазматической мембраны;

созревание и транспорт секретов;

созревание и транспорт ферментов лизосом.

С помощью везикулярного транспорта прошедшие через аппарат Гольджи белки доставляются «по адресу» в зависимости от полученных ими в аппарате Гольджи «меток».

Образование лизосом

Многие гидролитические ферменты лизосом проходят через аппарат Гольджи, где они получают «метку» в виде специфического сахара -- маннозо-6-фосфата (М6Ф)- в составе присоединенного к аминокислотной цепочке олигосахарида. Добавление этой метки происходит при участии двух ферментов. Фермент N-ацетилглюкозаминфосфотрансфераза специфически опознает лизосомальные гидролазы по деталям их третичной структуры и присоединяет N-ацетилглюкозаминфосфат к шестому атому нескольких маннозных остатков олигосахарида гидролазы. Второй фермент -- фосфогликозидаза -- отщепляет N-ацетилглюкозамин, создавая М6Ф-метку. Затем эта метка опознается белком-рецептором М6Ф, с его помощью гидролазы упаковываются в везикулы и доставляются в лизосомы. Там, в кислой среде, фосфат отщепляется от зрелой гидролазы.

Транспорт белков на наружную мембрану

Как правило, ещё в ходе синтеза белки наружной мембраны встраиваются своими гидрофобными участками в мембрану эндоплазматической сети. Затем в составе мембраны везикул они доставляются в аппарат Гольджи, а оттуда -- к поверхности клетки. При слиянии везикулы с плазмалеммой такие белки остаются в ее составе, а не выделяются во внешнюю среду, как те белки, что находились в полости везикулы.

475.98 Кб. Глава 6. Ядерный белковый матрикс

Общий состав ядерного матрикса

Мы уже познакомились с тем, что в интерфазном ядре развернутые

хромосомы располагаются не хаотично, а строго упорядоченно. Такая

организация хромосомы в трехмерном пространстве ядра необходима не только

для того, чтобы при митозе происходила сегрегация хромосом, их обособление

от соседей, но и кроме того необходима для упорядочения процессов

репликации и транскрипции хроматина. Можно предполагать, что для

осуществления этих задач должна существовать какая-то каркасная

внутриядерная система, которая может служить объединяющей основой для

всех ядерных компонентов – хроматина, ядрышка, ядерной оболочки. Такой

структурой является белковый ядерный остов или матрикс . Необходимо

сразу же оговориться, что ядерный матрикс не представляет собой четкой

морфологической структуры: он выявляется как отдельный морфологический

гетерогенный компонент при экстракции из ядер практически всех участков

хроматина, основной массы РНК и липопротеидов ядерной оболочки. От ядра,

которое не теряет при этом своей общей морфологии, оставаясь сферической

структурой, остается как бы каркас, остов, который иногда называют еще

«ядерным скелетом».

Впервые компоненты ядерного матрикса (остаточные ядерные белки) были

выделены и охарактеризованы в начале 60-х годов. Было обнаружено, что при

последовательной обработке изолированных ядер печени крыс 2 М раствором

NaCI, а затем ДНКазой, происходит полное растворение хроматина, а

основными структурными элементами ядра остаются: ядерная оболочка,

связанные с ней компоненты – нуклеонемы (ядерные нити), содержащие белок

и РНК, и ядрышки. Была высказана гипотеза, что фибриллы хроматина в

нативных ядрах прикреплены к этим осевым белковым нитям наподобие

«ершика для чистки бутылок» (см.

Значительно позднее (середина 70-х годов) эти работы получили развитие и

привели к появлению массы новых сведений о нехроматиновых белках

ядерного остова и о его роли в физиологии клеточного ядра. В это же время был

предложен термин «ядерный матрикс» для обозначения остаточных структур

ядра, которые могут быть получены в результате последовательных экстракций

ядер различными растворами. Новым в этих приемах было использование

неионных детергентов, таких как Тритон Х-100, растворяющих ядерные

липопротеидные мембраны.

Последовательность обработки выделенных ядер, приводящая к получению

препаратов ядерного матрикса, обогащенного белком, следующая (см. т

Таблица 6

. Экстракция (в %) ядерных компонентов в процессе получения

ядерного белкового матрикса

Обработка

Фосфолипи

1.Изолированны

2. 0,2 мМ MgCl

4. 1% Тритон Х-

5.ДНКаза+РНКа

Изолированные ядра, полученные в растворах 0,25 М сахарозы, 0,05 М Трис-

HCI буфера и 5 мМ MgCI

помещались в раствор низкой ионной силы (LS), где

деградировала основная масса ДНК за счет эндонуклеазного расщепления. В 2

М NaCI (HS) в дальнейшем происходила диссоциация хроматина на гистоны и

ДНК, шла дальнейшая экстракция фрагментов ДНК и различных белков.

Последующая обработка ядер в 1% растворе Тритона Х-100 приводила почти к

полной потере фосфолипидов ядерной оболочки и получению ядерного

матрикса (NM), содержащего остатки ДНК и РНК, которые дополнительно

растворялись при обработке нуклеазами, в результате чего получали конечную

фракцию ядерного белкового матрикса (NPM). Он состоит на 98% из

негистоновых белков, в него, кроме того, входит 0,1% ДНК, 1,2% РНК, 1,1%

фосфолипидов.

Химический состав ядерного матрикса, полученный таким способом сходен у

различных объектов (см.

Таблица 7

Фосфолипи

Крыса, печень 97 0,1 1,2

Клетки HeLa

Тетрахимена 97 0,1

По своей морфологической композиции ядерный матрикс состоит,по крайней

мере, из трех компонентов: периферический белковый сетчатый (фиброзный)

слой – ламина (nuclear lamina, fibrous lamina), внутренняя или

интерхроматиновая сеть (остов) и «остаточное» ядрышко (

Ламина представляет собой тонкий фиброзный слой, подстилающий

внутреннюю мембрану ядерной оболочки. В ее состав входят так же комплексы

ядерных пор, которые как бы вмурованы в фиброзный слой. Часто эту часть

ядерного матрикса называют фракцией «поровый комплекс – ламина» (PCL –

“pore complex – lamina”). В интактных клетках и ядрах ламина большей частью

морфологически не выявляется, т.к. к ней тесно прилегает слой

периферического хроматина. Лишь иногда ее удается наблюдать в виде

относительного тонкого (10-20 нм) фиброзного слоя, располагающегося между

внутренней мембраной ядерной оболочки и периферическим слоем хроматина.

Структурная роль ламины очень велика: она образует сплошной фиброзный

белковый слой по периферии ядра, достаточный для того, чтобы поддерживать

морфологическую целостность ядра. Так удаление обеих мембран ядерной

оболочки с помощью Тритона Х-100 не вызывает распада, растворения ядер.

Они сохраняют свою округлую форму и не расплываются даже в случае

перевода их в низкую ионную силу, когда происходит набухание хроматина.

Внутриядерный остов или сеть морфологически выявляется только после

экстракции хроматина. Он представлен рыхлой фиброзной сетью,

располагающейся между участками хроматина, часто в состав этой губчатой

сети входят различные гранулы РНП-природы.

Наконец, третий компонент ядерного матрикса – остаточное ядрышко –

плотная структура, повторяющая по своей форме ядрышко, также состоит из

плотно уложенных фибрилл.

Морфологическая выраженность этих трех компонентов ядерного матрикса,

так же как и количество во фракциях, зависит от целого ряда условий обработки

ядер. Лучше всего элементы матрикса выявляются после выделения ядер в

относительно высоких (5 мМ) концентрациях двухвалентный катионов.

Обнаружено, что для выявления белкового компонента ядерного матрикса

большое значение имеет образование дисульфидных связей. Так если ядра

предварительно инкубировать с иодацетамидом, препятствующим образованию

S-S связей, а затем вести ступенчатую экстракцию, то ядерный матрикс

представлен только комплексом PCL. Если же использовать тетратионат

натрия, вызывающий замыкание S-S связей, то ядерный матрикс представлен

всеми тремя компонентами. В ядрах, предварительно обработанных

гипотоническими растворами, выявляются только ламина и остаточные

Все эти наблюдения привели к выводу, что компоненты ядерного матрикса

представляют собой не застывшие жесткие структуры, а компоненты,

обладающие динамической подвижностью, которые могут меняться не только в

зависимости от условий их выделения, но и от функциональных особенностей

нативных ядер. Так, например, в зрелых эритроцитах кур весь геном

репрессирован и хроматин локализован преимущественно на периферии ядра, в

этом случае внутренний матрикс не выявляется, а только ламина с порами. В

эритроцитах 5-дневных куриных эмбрионов, ядра которых сохраняют

транскрипционную активность, элементы внутреннего матрикса выражены

отчетливо.

Как было видно из

7, основной компонент остаточных структур ядра –

ядерного матрикса из разных клеток довольно близок. Характерными для него

являются три белка фиброзного слоя, и носящих название ламинов . Кроме этих

основных полипептидов в матриксе присутствует большое количество

минорных компонентов с молекулярными массами от 11-13 до 200 кД.

Ламины представлены тремя белками (ламины A, B, C). Два из них, ламины

A и C, близки друг к другу иммунологически и по пептидному составу. Ламин

B от них отличается тем, что он представляет собой липопротеид и поэтому он

более прочно связывается с ядерной мембраной. Ламин B остается в связи с

мембранами даже во время митоза, тогда как ламины А и С освобождаются при

разрушении фиброзного слоя и диффузно распределяются по клетке.

Как оказалось, ламины близки по своему аминокислотному составу

промежуточным микрофиламентам (виментиновым и цитокератиновым),

входящим в состав цитоскелета. Часто фракция выделенных ядер, а также

препараты

ядерного

матрикса

значительные

количества

промежуточных филаментов, которые остаются связанными с периферией ядра

даже после удаления ядерных мембран.

В отличие от промежуточных филаментов ламины при полимеризации не

образуют нитчатых структур, а организуются в сети с ортогональным типом

укладки молекул. Такие сплошные решетчатые участки, подстилают

внутреннюю мембрану ядерной

оболочки, могут разбираться при

фосфорилировании

ламинов, и

полимеризоваться

дефосфорилированиии, что обеспечивает динамичность как этого слоя, так и

всей ядерной оболочки.

Молекулярная характеристика белков внутриядерного остова детально еще

не разработана. Показано, что в его состав входят ряд белков, принимающих

участие в доменной организации ДНК в интерфазном ядре в создании

розетковидной, хромомерной формы упаковки хроматина. Предположение о

том, что элементы внутреннего матрикса представляют собой сердцевины

розеточных структур хромомеров находит подтверждение в том, что

полипептидный состав матрикса интерфазных ядер (за исключением белков

ламины) и остаточных структур метафазных хромосом (осевые структуры или

«скэффолд») практически одинаковы. В обоих случаях эти белки отвечают за

поддержание петлевой организации ДНК.

ДНК ядерного белкового матрикса

Рассматривая особенности ДНК, входящей в состав ядерного матрикса,

необходимо еще раз подчеркнуть, что эта остаточная ДНК представлена в

минимальном количестве (0,1-1% от сухого веса фракции) составляет лишь

менее 1% от всей ДНК ядра. Эта ДНК оказалась устойчивой к действию

нуклеаз, вероятно за счет ее существования в виде прочных ДНК-белковых

комплексов.

Большой интерес представляет изучение фрагментов ДНК, входящих в состав

ядерного матрикса. Расчеты показали, что в ядрах существует от 60000 до

125000 участков ДНК, защищенных от действия нуклеаз и эти участки могут

быть расположены на всех трех компонентах ядерного матркса.

Подробно изучена ДНК ядерного матрикса клеток асцитной карциномы

Эрлиха мышей. Так были обнаружены две размерные группы фрагментов ДНК

в составе ядерного матрикса. В первую группу входили высокомолекулярные

фрагменты размером около 10 т.п.н., они составляли всего 0,02% от исходного

количества ДНК. Их число составляло примерно 100 на гаплоидный набор

хромосом, т.е. всего2-3 участка прикрепления ДНК к ядерному матриксу на

хромосому. Эти фрагменты были обогащены сателлитной ДНК и были связаны

с ламиной. Функциональное значение этих участков может состоять в

обеспечении фиксированного положения хромосом в ядре с помощью

закрепления их определенных участков (центромер, теломер) на ламине.

Вторая группа фрагментов, связанных с матриксом, состояла из небольших

участков ДНК (120-140 п.н.), гетерогенных по последовательности. Они

встречаются между участками ДНК длиной около 50 т.п.н., представляющих

собой, вероятно петли основной массы хроматина (

69). Функциональное

значение второй группы этих коротких участков ДНК может заключаться в том,

что они ассоциированы с белками, лежащими в сердцевинах розеткоподобных

структур хроматина или в основании развернутых петель ДНК хроматина при

его активации.

Сходные результаты были получены на многих объектах. Было обнаружено,

что зоны (районы) связывания ДНК с матриксом (MAR – matrix attachment

regions или SAR – scaffold attachment regions) содержат приблизительно 200 п.н.

и располагаются друг от друга на расстоянии 5-112 т.п.н. У дрозофилы на ядро

приходится по крайней мере 10 000 таких MAR (или SAR) областей.

Места расположения последовательностей SAR (MAR) очень сходны или

даже идентичны с местами связывания ДНК с топоизомеразой II, которая играет

основную структурную и ферментативную роль в образовании петель

хроматина. Более того один из белков матрикса («скэффолда») митотических

хромосом, белок Scl оказался просто топоизомеразой II. С помощью

иммунофлуоресценции было показано, что на интерфазных хромосомах Scl

локализуется в основании петель ДНК.

При изучении кинетики гидролиза вновь синтезированной ДНК нуклеазами

было обнаружено, что ядерный матрикс связан с репликацией ДНК. Было

обнаружено, что большая часть ДНК, содержащая радиоактивную метку,

связана с матриксом: свыше 70% новосинтезированной ДНК было локализовано

в зоне внутреннего ядерного матрикса. Это наблюдение давало основание

репликация ДНК. Фракция ДНК, ассоциированная с ядерным матриксом,

оказалась обогащенной репликативными вилками. В составе ядерного матрикса

обнаружена ДНК-полимераза

a, основной фермент репликации ДНК. Кроме

него с ядерным матриксом связаны и другие ферменты репликативного

комплекса (реплисомы): ДНК-праймаза, ДНК-лигаза, ДНК-топоизомераза II.

Высказана гипотеза о том, что репликация ДНК осуществляется таким образом,

что петли ДНК как бы протягиваются через закрепленные в матриксе

репликационные комплексы (

70). Было обнаружено, что участки начала

репликации ДНК располагаются вблизи (или совпадают с ними) участков

постоянного прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

В состав ядерного матрикса входит около 1% РНК, включающей в себя как

гетерогенную высокомолекулярную РНК, так и рибосомную РНК, и РНК

ядерных малых РНП. На возможность связи элементов матрикса с процессами

транскрипции указывали данные о том, что при коротком мечении матрикс

обогащался быстро меченной гетерогенной РНК. Было обнаружено, что в

состав белков внутреннего ядерного матрикса входит РНК-полимераза II,

ответственная за синтез информационных РНК. С ядерным матриксом клеток

яйцеводов кур оказалась связанной большая часть (95%) новосинтезированных

пре-мРНК овальбумина и пре-рРНК. Эти наблюдения привели к заключению,

что ядерный матрикс может выполнять структурную роль в синтезе,

процессинге и транспорте РНК в ядре.

С ядерным матриксом связаны собственно транскрибирующиеся гены.

Транскрипционные комплексы закреплены на ядерном матриксе, а сама

транскрипция осуществляется одновременно с перемещением матричной ДНК

относительно закрепленных транскрипционных комплексов, содержащих РНК-

полимеразу II. Кроме тРНК и ее предшественников в составе ядерного

белкового матрикса обнаруживаются малые ядерные рибонуклеопротеиды (мя

РНП), которые участвуют в созревании информационных РНК, в процессе

сплайсинга (см. ниже). Эти РНК-содержащие частицы, иногда называемые

сплайсосомами , собраны в группы или кластеры, связанные с белками

ядерного матрикса.

Элементы ядерного матрикса могут прямо участвовать в регуляции

транскрипции. Так участки MAR обычно связаны с такими регуляторными

последовательностями на ДНК как энхансеры и сайленсеры, определяющими

интенсивность

транскрипционных

процессов. На

матриксе

локализованы белки-рецепторы для ряда стероидных гормонов.

Относительно связи ДНК с элементами ядерного матикса на сегодня

сложились представления о том, что эта связь может отражать различные

функциональные особенности. Так связь ДНК с ламиной может отражать

структурную, постоянную ассоциацию ДНК, а связь с внутренними элементами

– функциональную, связанную как с синтезом ДНК, так и РНК,

Поведение белков ядерного матрикса во время митоза изучено еще далеко

недостаточно. О судьбе ламины при митозе уже было сказано: ее компоненты

разбираются, частично переходя в цитоплазму, частично (ламин В) оставаясь в

связи с мембранами. Относительно компонентов внутриядерного матрикса

сведений меньше: известно, что часть этих белков входит в состав матрикса

(«скэффолда») митотических хромосом.

Четвертый – хромонемный уровень упаковки хроматина

Исследуя структурную организацию хроматина и хромосом можно

определенно говорить о нескольких уровнях компактизации ДНК. Первый –

нуклеосомный, дающий 7-кратное уплотнение ДНК в составе фибрилл ДНП,

второй – 30 н.м. фибрилла или нуклеомерный уровень с40--70-кратной

степенью упаковки, третий – доменно-петлевой или хромомерный приводящий

к 600-700-кратному уплотнению ДНК в составе этих структур. Для

поддержания первых двух уровней компактизации было достаточно участие

только гистоновых белков, тогда как петлевые и розетко-подобные доменные

структуры уже требовали участия негистоновых белков, и перехода от

спирального или соленоидного типа укладки ДНК к образованию компактных

глобулярных структур, состоящих из петель хроматиновых 30-нм фибрилл, к

структурам типа хромомеров , имеющих уже размеры 0,1-0,2 мкм.

Однако еще в классических работах цитологов начала ХХ века как в

интерфазных ядрах, так и, особенно, в митотических хромосомах описывались

нитчатые структуры – хромонемы , имеющие толщину 0,1-0,2 мкм. Их

удавалось наблюдать как на фиксированных объектах, так и в живых клетках.

Подробные исследования ультраструктуры митотических хромосом на разных

этапах митоза с помощью электронной микроскопии полностью подтвердило

наличие этого четвертого уровня компактизации хроматина (

При изучении ультраструктурных основ строения митотических хромсом

необходимо учитывать хромонемный уровень компактизации хроматина.

Хромонему – нитчатую хроматиновую структуру со средней толщиной 0,1-0,2

мкм удается проследить в естественных условиях на разных стадиях начальной

конденсации хромосом в профазе митоза и при деконденсации хромосом в

телофазе. Причем такие хромонемы выявляются как в клетках растений, так и

животных (

Изучение профазных хромосом как животных, так и растений показывает, что

процесс конденсации хромосомного материала включает в себя промежуточный

этап – образование из фибрилл ДНП нитчатых хромонемных структур,

являющихся единицей последующей хромосомной структуризации.

В естественных условиях в составе метафазных хромосом хромонемные

элементы на ультратонких срезах не выявляются. Но по мере деконденсации

митотических хромосом в поздней анафазе и ранней телофазе снова можно

видеть признаки хромонемной организации хромосом. В поздней анафазе, когда

хромосомы достигают противоположных полюсов клетки, в их структуре снова

выявляются хроматиновые нитчатые образования с толщиной 0,2 мкм. При

этом вся структура хромосом разрыхляется, что отражает начало общей

деконденсации митотических хромосом. Эта начальная стадия деконденсации

связана не с разрыхлением фибрилл ДНП внутри хромонем, а с расхождением,

обособлением участков хромонемы друг от друга. Особенно заметным и

выраженным этот процесс становится в телофазе. В это время хромосомы

начинают увеличиваться в объеме, при этом расстояние между отдельными

участками хромонемы также возрастает. В расположении отдельных нитей

хромонемы, так же как и в профазных хромосомах, улавливаются признаки

спиральности в их укладке: часто видны кольчатые или петлистые незамкнутые

участки, иногда располагающиеся параллельно друг другу. Спиральность

хромонемы в составе митотических хромосом удается наблюдать в ряде случаев

при частичной искусственной деконденсации выделенных митотических

хромосом (

74). В поздней телофазе хромосомы уже полностью окружены

ядерной оболочкой. Хромонемные элементы расходятся на значительные

расстояния, но все же зоны отдельных хромосом еще выявляются. В это время

некоторые участки хромонем начинают разрыхляться, их толщина взрастает.

Таким образом, наблюдая за состоянием структуры и расположением

хромонемных участков в ядрах и хромосомах в телофазе, можно видеть

картину, обратную той, что наблюдалась в профазе: разрыхление хромосом за

счет первоначального расхождения участков хромонемы и последующего их

разрыхления, деконденсации самих хромонем.

Ультраструктурная организация хромонемного уровня упаковки ДНП

хорошо выявляется при постепенном экспериментальном разрыхлении

хромосом при понижении концентрации двухвалентных катионов. Оказалось,

что плотное тело митотических хромосом сначала разрыхляется так, что

выявляется его хромонемная организация: на срезах видно, что хромосомы

представлены сечениями толстых (0,1-0,2 мкм) хромосомных нитей, хромонем

73). Затем, при последующем снижении концентрации двухвалентных

катионов, происходит как бы распад хромонемных элементов на множество

линейно расположенных глобулярных блоков хроматина с диаметром около

0,1-0,2 мкм. В

дальнейшем

блоки (хромомеры) начинают

деконденсироваться: на их периферии видны петли фибрилл ДНП, а в центре

остается тело хромомера. Возникает розеткоподобная структура. Важно

отметить, что расположение зон с розеткоподобными хромомерами совпадает с

рисунком G-бэндирования хромосом. По мере дальнейшей деконденсации

петли увеличиваются в длину, а центральные участки хромомеров прогрессивно

уменьшаются. При полной деконденсации все тело хромосомы представлено на

срезах равномерно расположенным фибриллами ДНП.

Надо отметить, что в современных молекулярно биологических

исследованиях строения хромосом хромонемный уровень, как один из высших

уровней упаковки ДНП, совершенно выпадает из поля зрения исследователей.

Лишь в последнее время некоторые исследователи на основании косвенных

данных приходят к выводам о наличии в интерфазных ядрах хромонемо-

подобных структур.

Ядрышки – плотные, интенсивно окрашенные округлые образования в ядре размером 1-2 мкм. Их может быть несколько. Ядрышки образуются в ядре в области ядрышковых организаторов, которые обычно располагаются в области вторичных перетяжек некоторых хромосом. Там находятся гены, кодирующие рибосомную РНК. Ядрышки состоят из гранулярного и фибрилярного компонентов. Гранулы ядрышек представляют собой субъединицы рибосом, а нити – молекулы образовавшейся рибосомной РНК. Последние связываются с белками, поступающими из цитоплазмы, с образованием субъединиц рибосом. Эти субъединицы через ядерные поры выходят в цитоплазму, где объединяются в рибосомы и связываются с информационной РНК для синтеза белка. Чем выше функциональная, синтетическая активность клетки, тем многочисленней и крупнее её ядрышки.

Транскрипция нерибосомных генов.

Ядерный белковый матрикс.

Кариоплазма (ядерный сок) – жидкий компонент ядра, истинный раствор биополимеров, в котором во взвешенном состоянии расположены хромосомы и ядрышко. По своим физико-химическим свойствам кариоплазма близка к гиалоплазме.

Ядерная оболочка.

Ядерная оболочка отделяет ядро от цитоплазмы, отграничивает его содержимое и обеспечивает обмен веществ между ядром и цитоплазмой. Ядерная оболочка состоит из двух биологических мембран , между которыми расположено перинуклеарное пространство шириной 15-40 нм. Наружная мембрана ядра покрыта рибосомами и переходит в мембраны гранулярной эндоплазматической сети. К внутренней мембране прилежит слой белковых филаментов (ламина ) кариоскелета, через который к ядерной оболочке прикрепляются хромосомы (рис. 2-9).

В ядерной оболочке имеются отверстия – ядерные поры диаметром 90 нм (рис. 2-10). Они являются не просто отверстиями, а очень сложно организованными комплексами пор. В их состав входят белки, которые образуют по краю поры три ряда по 8 гранул, а в центре поры расположена 1 гранула, связанная белковыми нитями с периферическими гранулами.

При этом образуется перегородка, диафрагма толщиной 5 нм. Эти комплексы пор обладают избирательной проницаемостью: через них не могут пройти мелкие ионы, но переносятся длинные нити информационной РНК и субъединицы рибосом.

В ядре имеется несколько тысяч пор, занимающих от 3 до 35% его поверхности. Количество их значительно больше в клетках с интенсивными синтетическими и обменными процессами. В ядерных оболочках зрелых сперматозоидов, где биосинтез белка не происходит, поры не обнаружены. Замечено также, что чем выше функциональная активность клетки, тем сильнее извита кариолемма (для увеличения площади обмена веществ между ядром и цитоплазмой).